严重感染的免疫紊乱、免疫监测与免疫治疗
严重感染是重症医学科(ICU)的主要疾病之一，51%的ICU患者存在感染，并随着入住的时间的延长，其发病率也相应增加。美国每年至少有750 000的患者发生严重感染及感染性休克并有逐年增加的趋势。近年来，严重感染患者出现的免疫功能紊乱受到广泛关注。其中，严重感染出现的"细胞因子风暴"及其继发的免疫抑制被认为是主要的病理生理过程。免疫抑制可降低机体对抗原的反应性、清除能力，易于发生二次感染。许多研究针对这一过程进行了干预，但阳性结果不多。这不仅与个体的差异有关，更与干预的时机有关。因此，对患者的免疫功能进行动态的监测，根据监测结果个体化地调整治疗方案，可能会进一步降低严重感染及感染性休克患者的死亡率。
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一、严重感染的免疫紊乱进展
1．严重感染与"细胞因子风暴"：
严重感染会引起高热，休克及呼吸衰竭，并产生大量不同的细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素1(IL－1)，其浓度随着疾病的严重程度加剧而增加。因此，提出严重感染是一种不可控的炎症反应。于是，将这个快速产生大量细胞因子的过程，称作"细胞因子风暴"。其中包括促炎细胞因子和抗炎细胞因子，前者如TNFα，IL－6, IL－8，集落刺激因子(GM－CSF)等；后者如IL－10等。机体的免疫细胞通过病原相关分子模式(PAMP)与模式识别受体(PRRs)结合，识别抗原，产生大量促炎细胞因子，激活损伤相关分子模式(DAMP)，如热休克蛋白及高迁移率族蛋白1(HMGB1)，释放大量趋化因子，与细胞间黏附分子(ICAMs)结合，易引起呼吸、循环、肾脏的急性损害。
细胞因子风暴的强度往往存在个体差异。感染发生后，一些患者出现的细胞因子风暴强度适中，这些细胞因子能够清除侵入人体的病原微生物，而对人体自身损害较小。而有些患者可能发生非常强烈的细胞因子风暴，在清除病原微生物的同时，也对自身的器官功能产生明显的损害。一个既往健康、年轻的严重感染患者，会由于"细胞因子风暴"介导的过度炎症反应，表现出休克，高热及多器官衰竭。还有一些患者本身免疫功能低下，在病原微生物入侵后，不能产生足够强的细胞因子风暴，导致病原微生物在体内快速繁殖，病情加重。如果是一个老年、行血液透析的严重感染患者，可能不会出现明显的过度炎症反应，临床表现为意识状态下降、耐受透析能力下降、低血压、低氧血症及葡萄糖耐量下降等症状。
2．严重感染与免疫抑制：
严重感染的细胞因子风暴可能损伤机体的细胞、组织和器官功能，其中也包括免疫系统自身。免疫细胞，如T细胞、B细胞及树突细胞，均可出现活性及功能均减弱，甚至凋亡。由于严重感染不仅能够通过死亡受体途径，而且也能够通过线粒体介导的途径，使免疫细胞发生凋亡。因此，阻滞单一的信号传导途径，是不能有效的阻止淋巴细胞的凋亡。T细胞调节细胞(Treg)和髓样抑制细胞(MDSC)是免疫抑制细胞，因为严重感染不能引起其凋亡，故数量比例增多。T细胞耗竭在严重感染、寄生虫病、人类免疫缺陷病毒(HIV)及癌症患者比较多见。有研究发现，严重感染引起患者的死亡与T细胞耗竭有关，如IFNγ、TNF的产生减少，CD4＋ T细胞的抑制程序性细胞死亡因子1(PD1)抗体表达增加，巨噬细胞的程序性细胞死亡因子配体1(PDL1)表达增加，T细胞上的CD127表达减少。循环系统中T细胞PD1表达增加，可能由于T细胞增殖的能力下降引起。动物研究发现，抑制PD1－PDL1的相互作用，能够抑制T细胞的耗竭，提高生存率。严重感染时，CD4＋TH细胞发挥了最重要的作用。可通过组蛋白甲基化和染色体重塑，通过作用于启动子上的IFNG和GATA3基因，使Th1和Th2细胞的功能受到抑制。Th17细胞可通过产生IL－17和IL－22，抑制严重感染的发展，TH17细胞的缺乏，可引起继发性真菌感染。严重感染患者血液中Treg细胞数量增加，可能由于效应T细胞减少的数量多于Treg细胞减少的数量。研究发现，Treg细胞在严重感染时，其抗凋亡蛋白BCL－2的表达增多。Treg细胞可通过siRNA特异作用于FOX3基因，抑制Treg细胞的分化，使其数目相对增加，引起T细胞的增殖能力和功能的下降。单核细胞可引起促炎细胞因子(如TNF、IL－1α、IL－6、IL－12)的减少，抗炎细胞因子(如IL－1RA、IL－10)功能不变或增强。mRNA表达水平分析，抗炎细胞因子及其信号传导通路的表达增加，促炎细胞因子的表达下降。有研究发现，这可能是由于组蛋白的修饰和染色体重塑引起的。表观遗传学可影响单核细胞细胞因子的释放，IFNγ可通过Toll样受体介导的染色体重塑，减弱免疫耐受。免疫耐受对单核细胞及巨噬细胞的主要影响表现为免疫抑制介质释放增加，抗原递呈能力下降，通过阻断IL－10的产生，减轻免疫抑制并提高生存率。减少单核细胞HLA－DR的表达，可发生继发感染，甚至死亡。因此，单核细胞HLA－DR的表达可作为评价患者可能发生继发感染的独立因素。中性粒细胞在严重感染的早期1 h内功能发生改变。自骨髓成熟后，通常在24 h内发生凋亡。严重感染的患者，其中性粒细胞凋亡减慢，而淋巴细胞的凋亡相对较快。有研究发现，严重感染患者血液中存在大量分化程度不同的中性粒细胞，其中未成熟的中性粒细胞所占比例较大，成熟的中性粒细胞凋亡延迟。大量动物实验表明，严重感染能够引起中性粒细胞功能的损害，如消灭病原的能力下降，产生活性氧(ROS)的能力减弱，尤其表现出感染部位趋化能力的下降。可能与Toll样受体信号传导的受损有关。中性粒细胞的功能损伤，更易引起继发感染。给予严重感染的患者使用供体中性粒细胞行体外细胞治疗，能够提高患者不同的生物标志物，缓解病情。尽管中性粒细胞一般情况下，不能够产生大量的细胞因子，但在严重感染时，可释放大量抗炎细胞因子，如IL－10。成熟的CD16CD62L中性粒细胞(L－选择素)，在严重感染时，能够抑制T细胞的增殖，引起严重的免疫抑制。MDSC细胞在严重感染的不同阶段，可增加或减轻炎症的反应。但由于MDSC细胞表型复杂多样，并且国际上没有公认的表型定义，所以，相关的研究不是太多。
严重感染时，浆细胞及树突细胞均发生凋亡。继发的院内感染死亡的患者树突细胞明显减少。研究发现，严重感染的患者，其树突细胞不仅数量减少，存活的树突细胞表面的HLA－DR表达降低，IL－10数量增加。单核细胞源性树突细胞，不能引起有效的T细胞效应，反而减弱T细胞的敏感性或引起Treg细胞增殖。FLT3L是树突细胞的一种生长因子，能够促进IL－12、IL－15、IFNγ的产生，增加CD4＋T细胞、NK细胞、中性粒细胞的功能。
NK细胞主要存在于组织中，而非血液循环中，因此，相关研究相对较少。严重感染使NK细胞亚群种类减少，数目减少，其产生的IFNγ也相对减少，可引起巨细胞病毒反应及病毒的潜伏。
3．严重感染：
免疫亢进还是免疫抑制：由于严重感染常常伴随过度的炎症反应，人们曾认为存在免疫亢进，临床的治疗主要是使用药物抑制炎症反应或血液净化清除细胞因子。近年来，更多的研究表明，严重感染常常存在免疫功能明显下降，表现为较长时间的免疫抑制。临床上也常常可以观察到二次或多次感染的患者，在病情相对稳定之后再次出现高热、休克加重等表现，表现为细胞因子风暴与免疫抑制交替出现。因此，不能一成不变地认为严重感染是单纯的免疫亢进或单纯的免疫抑制。典型的严重感染患者病理生理表现为：早期以"细胞因子风暴"为特征的过度炎症反应，是一种免疫亢进；继之出现细胞因子减少、免疫细胞功能下降的免疫抑制。但由于严重感染患者的免疫功能变化复杂，影响因素众多，往往具有明显的个体性差异。有的患者由于细胞因子风暴过强，可能早期出现循环崩溃，尚未表现出免疫抑制即出现死亡；有的患者由于基础免疫功能低下，根本表现不出细胞因子风暴，直接出现免疫抑制加重；有的患者由于感染反复，细胞因子风暴和免疫抑制可以多次交替出现。由此可见，严重感染患者的免疫功能不仅是动态的、连续变化的，而且是个体化的，易受影响的。所以，对严重感染的患者进行免疫功能的动态监测是必要的，是实现个体化免疫治疗的基础。
二、严重感染的免疫监测进展
人们现在更多地认识到机体免疫功能在严重感染过程中变化之复杂，影响之大。因此，需要对患者进行及时、准确的对免疫功能评价。近年来，出现了一些新的监测免疫功能的方法，大多是根据严重感染造成免疫细胞的改变，来反映机体免疫功能的损伤。但由于患者的免疫状态存在个体差异，且处于动态的变化中，因此，需要寻找能够个体化、动态的反映患者的免疫功能状态的方法。
1．细胞水平的测定：
中性粒细胞、淋巴细胞的百分比，是传统的判断机体感染的指标，但是由于其受干扰因素比较多，特异性低，化验间断，费时，对免疫功能的提示作用不大。有研究发现，严重感染患者外周血中树突细胞(DC)计数明显降低，临床预后不佳。
2．免疫分子水平的测定：
包括血清中的抗体、补体、细胞因子及细胞表面黏附分子等，其中外周血中单核细胞HLA－DR的表达水平是评估严重感染患者免疫状态公认的监测指标，能够明显反映患者的"免疫麻痹"及免疫抑制状态，Landelle等的研究发现，严重感染患者的mHLA－DR表达的降低与ICU内二次感染的发生有明显的相关性。研究发现，单核细胞CD86的表达量与脓毒症的发生有着密切的联系，可与mHLA－DR联合反应机体的免疫功能状态。但由于测量mHLA－DR的技术在各检测中心尚未达到标准化，如HLA－DR的阳性率、分子数目及荧光强度等，仅能作为临床免疫功能监测的参考指标。
3．ImmuKnow－Cylex监测技术：
ImmuKnow－Cylex监测技术是通过刺激CD4细胞产生ATP酶的方法来定量监测人体免疫状态的一种最前沿的检测方法，可标准化、快速监测CD4＋T细胞、T细胞亚群及NK细胞等功能，已通过美国FDA批准，用于监测器官移植受着的免疫功能状态。但是，这项技术是否可用于严重感染的患者还需更多的研究试验。同时，我国专家姚咏明教授正在创建国际化的免疫功能评分系统，能够更全面的系统评价严重感染患者的免疫功能状态。
三、严重感染的个体化免疫治疗进展
虽然严重感染患者免疫紊乱存在个体化的差别，但如果能够根据患者的实际免疫状态，制定个体化的免疫治疗方案，即对处在较强"细胞因子风暴"阶段的患者选择抑制或清除细胞因子治疗手段，达到免疫平衡；而对处于免疫抑制阶段的患者采用免疫刺激的治疗方法，或可提高严重感染患者的生存率。
1．针对严重感染"细胞因子风暴"的治疗：
严重感染的患者在感染早期(1～2 d)，会出现"细胞因子风暴"。有关炎症抑制药物的研究，如内毒素抗体等单克隆抗体，TNFα拮抗剂、IL－1R拮抗剂等，虽然在动物实验中有一定的疗效，但在临床研究中，可能由于细胞因子风暴产生细胞因子的种类之多，个体差异之大，干预时患者免疫状态也不同，因此试验结果无明显作用。糖皮质激素在严重感染及感染性休克的应用存在一些争议。《2012严重感染及感染性休克治疗指南》就糖皮质激素的使用提出推荐意见：如果液体复苏及血管活性药物不能够维持血流动力学稳定，推荐每天静脉持续泵入氢化可的松200 mg。这一推荐主要是针对血流动力学不稳定的患者采用的。从免疫的角度来看，在细胞因子风暴阶段，糖皮质激素具有强大抗炎作用，能够通过多种途径抑制细胞因子的产生，有助于器官功能的保护和预后的改善。但在免疫抑制阶段，继续使用糖皮质激素或长时间使用可能会进一步降低机体自身的免疫系统功能。因此，糖皮质激素，包括其他免疫抑制药物在临床实验产生阴性结果的原因可能在于没有在严重感染的合适阶段(细胞因子风暴)进行干预。未来的临床研究应根据患者的细胞因子风暴监测来决定免疫抑制治疗开始的时机和持续的时间。乌司他丁(UTI)是从人尿中提取的酸性糖蛋白，属蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶具有良好抑制作用。此外还具备稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放，清除氧自由基，减少炎症介质细胞因子如TNF－α、IL－6、IL－8、CRP等的释放。黄惠斌等使用基因芯片技术检测脓毒症大鼠肝组织基因表达中发现，乌司他丁能够减少钙结合蛋白S100a8的表达，减少炎症反应相关基因Cxcll的表达，从而减少中性粒细胞游走到外周组织导致器官的损伤；同时，通过上调Scos2的表达，阻断细胞信号转导通路，减少细胞因子的释放，实现对组织器官的保护。近年来，血液净化治疗被用来清除严重感染及感染性休克患者的细胞因子，以期降低细胞因子风暴，改善患者预后。一些小型研究发现高容量血液滤过(HVHF)能够明显降低严重感染患者血液中的炎症介质水平，并且早期行HVHF治疗较晚期治疗严重感染的患者预后好。但最新的一项多中心临床试验(IVOIRE)表明，HVHF治疗感染性休克伴急性肾损伤的患者，血流动力学及28 d死亡率无明显益处。多黏菌素B包被的血液灌流器，既能够吸附内毒素，又能减少细胞因子如IL－15、IL－6、IL－10及TNF－α等的释放，使HMGB1的含量下降，CD4＋CD25＋Foxp3＋调节T细胞表达下降，CD16单核细胞的HLA－DR表达增加，减轻了严重感染的免疫抑制状态。开展了一项随机对照试验(EUPHAS)对腹腔感染并发感染性休克的患者使用多黏菌素B血液灌流器进行血液灌流治疗，能显著降低患者的病死率。但最新的研究发现，早期使用多黏菌素B血液灌流器治疗腹膜炎引起的感染性休克效果并不理想。联合血浆滤过吸附(CPFA)，理论上能够清除细胞因子并调节内环境，但一项多中心随机对照研究发现CPFA不能够降低死亡率。上述血液净化治疗严重感染的临床试验多数结果为阴性，原因可能有很多，但其中一个不能忽视的原因是血液净化治疗严重感染的时机。应从免疫发病机制来看，在严重感染的细胞因子风暴阶段，血液净化从理论上可以清除促炎和抗炎细胞因子，有助于达到"免疫平衡"状态；但在严重感染的免疫抑制阶段，血中细胞因子的浓度已经下降，没有必要采用血液净化的方式来清除细胞因子。因此，没有区分患者的免疫状态，在合适的时间窗内实施清除细胞因子为目的的血液净化治疗，可能是近年来采用这种方法治疗严重感染的临床试验出现阴性结果的主要原因。亚低温作为一种有效的临床干预方法，具有器官保护的作用，目前已成为心跳骤停后脑复苏及重度颅脑损伤的标准治疗。其作用机制除了降低器官氧代谢率，改善细胞缺氧状态外，还能抑制细胞因子释放，减少继发损伤。但亚低温干预同样需要注意时机，如果在严重感染的免疫抑制时相进行亚低温治疗，则可能加重已经存在的免疫抑制，影响患者预后。
2．针对严重感染免疫抑制状态的免疫刺激治疗：
阻断细胞因子的药物通常使用在细胞因子显著升高的患者早期，且持续时间较短。机体随后会出现免疫抑制，除使用有效的抗菌药物及防止再次感染，针对免疫监测发现的免疫抑制个体化地选用免疫刺激药物提高患者的免疫功能将成为重要有效的治疗方法。(1)粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)：GM－CSF能够激活并诱导中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞产生细胞因子，为免疫的刺激治疗提供了可能。一项多中心，随机对照双盲安慰剂对照试验表明，使用GM－CSF治疗严重感染的患者，免疫功能有所恢复，缩短了机械通气时间及ICU住院天数。Hall等使用GM－CSF治疗严重感染的儿童患者，治疗前，患者的TNFα<200 pg/ml，处于明显的免疫抑制，治疗后，其产生TNFα的能力恢复，且出现继发感染的情况减少。IL－7是一种具有免疫多能性的细胞因子，能够诱导T细胞的增殖，增加T细胞活化的能力，增加细胞黏附分子的表达，降低免疫抑制的程度。早期有研究发现，IL－7能够增加CD4＋和CD8＋的数量，并能使脾脏及外周淋巴结大小增加一半。在多重感染的小鼠实验中发现，IL－7能够使淋巴细胞的凋亡率降低，对抗TNF－γ(恢复巨噬细胞的功能)，提高生存率。在其他病毒感染的临床试验中发现，IL－7极少引起发热、毛细血管渗漏综合征或与细胞因子有关的临床异常症状。因IL－7在细菌、病毒的动物模型及临床试验中有良好的疗效，IL－7在严重感染及感染性休克患者的治疗上，会有可观的前景。胸腺肽α1能够调节机体树突细胞的功能，对免疫抑制的患者可增加免疫功能。Wu等开展的一项多中心、单盲、随机对照试验(ETASS)发现，使用胸腺肽α1的患者免疫功能较对照组显著提高，28 d病死率为26%，低于对照组(35%)。胸腺肽α1可有效提高严重感染患者的免疫功能，改善预后。(4)抑制程序性细胞死亡因子1(PD－1)及程序性细胞死亡因子配体1(PD－L1)：PD－1是T细胞上的一种刺激分子，可通过与PD－L1的结合，抑制T细胞的增殖及细胞因子的产生，可引起细胞毒的作用。使用PD－1及PD－L1的抗体，可逆转T细胞的功能障碍，清除病原体。临床研究发现，循环T细胞上的PD－1的表达量，与患者T细胞的增殖能力下降、继发感染及死亡率增加有关。同时，PD－1及PD－L1可作为一种生物标志物，来评价是否可以使用其抗体来提高机体免疫功能。但PD－1及PD－L1的抗体用于治疗的安全性和疗效还有待进一步研究。干扰素γ是单核细胞和巨噬细胞的活化因子。Nalos等使用干扰素γ治疗持续性感染金黄色葡萄球菌的脓毒症患者，发现干扰素γ可以增加单核细胞HLA－DR的表达，提高CD4＋T细胞的数量，改善预后。干扰素γ已经用于治疗慢性肉芽肿患者继发真菌的脓毒症。
此外还有白介素15(IL－15)和B细胞和T细胞衰减因子(BTLA)等治疗药物。但是，免疫刺激的治疗仍然存在个体化的问题，每个严重感染及感染性休克的患者免疫抑制的程度、持续时间、伴随疾病不尽不同。因此，还需进行相关的评估，根据动态免疫监测的结果，来选择合适的治疗药物及治疗时间。
严重感染及感染性休克的免疫紊乱过程复杂，目前在严重感染的免疫治疗方面，许多实验室及临床试验以失败告终。但是，凭借未来标准化的动态免疫监测方法的产生，可对严重感染患者的免疫状态进行动态的监测和评估，指导个体化分层的免疫治疗，如在细胞因子风暴阶段采用清除细胞因子的治疗，而在免疫抑制阶段采用免疫刺激治疗。个体化的免疫治疗策略有望成为改善严重感染及感染性休克患者预后的又一突破，当然，这还有待于更多的临床研究去证实。
引用: 张祎超, 杨荣利. 严重感染的免疫紊乱、免疫监测与免疫治疗进展 [J] . 中华医学杂志, 2016, 96(21) : 1708-1712.书籍广告
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